建立於 03 九月 2015
分類：專題報導
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3．3 核酸雜交技術
核酸雜交技術是利用特定標記的DNA或RNA探針和病原體生物中的與探針互補的靶核苷酸序列進行雜交，以此來確定宿主是否攜帶有病原體的一類分子生物學技術，可分為Southern雜交、Northern雜交和核酸原位雜交。該技術以其靈敏度高、特異性強和檢驗快速等優點，近年來在對蝦病毒等水產養殖病原體檢測中倍受青睞。Subramanian（1993）利用所合成的CDNA探針，通過核酸雜交試驗檢測感染細胞和組織中的水和呼腸弧病毒的dsDNA獲得成功；Lupinai等（1993）應用製備的RNA探針通過RNA－RNA印迹雜交法分離鑒定出一種新的病毒即水生呼腸弧病毒A群。Dopazo （1994）等將製備的cDNA探針用於IPNV的檢測和診斷，從接種病毒4～8h的培養細胞中即檢測到IPNV。
3‧4 PCR技術
聚合酶鏈式反應（PCR）是體外酶促合成迅速擴增特異DNA片段的一種方法。在魚類等動物疾病診斷中PCR技術的應用才剛剛開始，就已經顯示出其巨大的潛力及廣闊的應用前景（Davies etaL 1994）。Arakawa（1990）等應用PCR技術檢測了虹鱒魚IH－NV，並以生物素標記的寡核苷酸探針鑒定了產物的特異性。Boyle（1991）等用PCR法檢CCV的DNA，靈敏度達0．lpg，並成功地檢測出CCV攜帶者。Lastra（1994）等應用逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT－PCR）對經培養細胞分高純化的病毒進行檢測，靈敏度達到lpg；另外，他們還對銀大馬哈魚、鱒魚組織中的IPNV進行檢測並進行擴增。對於其他水生動物病毒的檢測，早在1990年就有關於應用PCR技術從對蝦組織中檢測出核型多角體病毒的報導（Vickers，1990）。Chang等利用PCR技術首次成功地進行對蝦病毒的擴增。Wang等（1996）用PCR方法檢測對蝦杆狀病毒，並獲得了預計的擴增產物。此外，應用PCR技術也可檢測貝類腸
道病毒以及水或水生生物體內富集的病毒或細菌。
4 免疫防治技術
4‧1 免疫增強劑
包括特異性免疫和非特異性免疫增強劑，但更多的是增強非特異性免疫機能。其主要是通過活化自身的免疫機能而顯示機體的防禦效果，具有作用廣泛、安全性高等特點。免疫增強劑的功能是多方面的，在甲殼動物中，可活化血淋巴中的吞噬細胞，提高吞噬病原菌能力；刺激血淋巴中抗菌、溶菌活力的產生或升高；啟動酚氧酶原系統產生識別信號及介導吞噬等。在魚類中，可啟動嗜中性粒細胞及巨噬細胞的吞噬作用；啟動淋巴細胞產生或分泌淋巴因數以協調體液免疫和細胞免疫；刺激抗體的產生和補體的生成等。目前應用較多的免疫增強劑主要有葡聚糖、脂多糖、細菌多肽、左旋咪華、幾丁質、雞蛋產物、維生素和激素等。Hardie等 （1991）討道給予大量維生素C的魚類，其補體活動水平得到提高。大西洋鮭魚經注射酵母葡聚糖後，也表現出補體活動得到提高（Engstad etal．1992）；使用免疫增強劑也能夠影響溶菌酶的活性，溶菌酶是一種水解酶，存在於魚類的粘液、血清和巨噬細胞中，能殺死病原微生物而使魚體獲得保護（Engstad et al．1992）。此外，NK細胞也能被生長激素（Kajita et al．1992）和左旋咪華（Kajita et al．1990）所啟動。
4‧2 DNA疫苗
在水產動物疾病防治上，傳統的疫苗是用滅活菌體疫苗或弱毒性的菌體疫苗，前者往往效果不明顯，後者卻仍可造成輕微感染或回復突變為病原株的危險。DNA疫苗又稱基因疫苗或核酸疫苗，它是將病毒或微生物中負責轉譯抗原蛋白的基因片段分離出來，在體外與載體連接形成重組DNA，然後轉移入宿主細胞，在宿主細胞內表達抗原蛋白，達到免疫的效果。這種疫苗製備方法簡單，成本低，適宜大規模生產，它在體內能長期表達，不斷刺激機體的免疫系統，可組成多價疫苗，即一種疫苗能誘導產生針對多個抗原表位的免疫保護作用。魚用DNA疫苗主要針對的是病毒性魚病，目前研究應用的有出血性敗血病毒（VHSV）、傳染性造血組織壞死病毒（IHNV）、傳染性胰臟壞死病毒（IPNV）、鰻魚病毒（EVA、EVEX）、草魚呼腸弧病毒（FRV）、文蛤病毒等疫苗。Lorenzen （1999）針對VHSV病毒G蛋白構建的DNA疫苗能夠誘導70％的虹鱒產生較高水準的免疫保護性。Traxler（1999）等以編碼IHNV病毒G蛋白（PCMV4－G）的裸DNA免疫大麻哈魚，8周後，用IHNV病毒攻擊，保護率可達40％～100％。當然，DNA疫苗作為一代新型疫苗，還有不完善的地方，其中最引人關注的是安全性問題，人們擔心DNA疫苗會整合到宿方的染色體上造成插入突變，不過目前在實驗中尚未發現這種現象。
4‧3 反義技術
反義技術是近十多年來發展起來的反義核酸技術和核酶技術的總稱，可以用來特異性地阻斷病毒功能的發揮。反義核酸可分為反義RNA技術和反義DNA技術，但一般常指反義RNA技術。反義RNA是以DNA有義鏈為模板合成的RNA及其衍生物，它可通過與相應的mRNA互補結合而阻斷其功能。1985年首次將病毒存活所必需的酶基因或結構基因的反義核酸和表達載體連接，轉入細胞內或將反義核酸直接注入細胞，發現者對病毒有抑制作用。目前，使用人工合成的反義RNA已在原核細胞和真核細胞中成功地抑制了多種病毒基因的表達。核酶則是一種具有催化作用的RNA，它通過堿基配對與靶RNA相互識別。結合並催化水解靶RNA，因此它既有反義RNA的作用，又能以序列特異性地切割RNA。實驗證明，核酶也可以抑制病毒的複製和表達，轉入基因可以傳代，現在已有不少研究顯示核酶可用於對病毒靶RNA進行切割。不過目前還未見到有關成功應用反義技術來治療水產養殖動植物病毒性疾病的報導，但作為一種特異性較強的檢測技術，反義技術是很有開發潛力的。
5 環境生物修復技術
水生環境日趨惡化，對漁業造成極大危脅，病害的暴發主要是由環境污染所造成的。環境生物修復技術是一個新的研究發展領域，國外採用生物修復技術改良水生環境，已取得新的進展。所謂環境生物修復技術就是利用生物製劑去除水生環境中的有害廢棄物，應用微生物的機理，降解多種污染物，改善水生環境。生物修復是比生物降解含義更為廣泛，又以生物降解為重點的環境生物技術。其方法包括利用活機體、或其製作產品降解污染物，減少毒性或轉化為無毒產品，富集和固定有毒物質（包括重金屬等），大尺度的生物修復還包括生態系統中的生態調控等。這種生物技術可以應用水產規模化養殖和工廠化養殖、石油污染、重金屬污染、城市排汙以及海洋其他廢物（水）的處理等方面。關於微生物對環境反應的動力學機制、降解過程的生化機理、生物感測器、海洋微生物之間以及與其他生物之間的共生關係和互利機制，抗附著物質的分離純化等領域的研究有待於進一步深入。目前已進行的研究有：研究轉重金屬硫蛋白基因藻類對海水環境中重金屬的吸附能力；五油降解微生物在修復被五油污染的水環境上的可行性及應用潛力；海洋磁細菌在去除和回收海水環境中重金屬上的應用潛力；用杆狀菌清除養魚場污水中的氮，用分子技術篩選作為海水養殖餌料的微藻，分離出耐冷的癸烷降解細菌，研究了海洋環境中多芳香化烴的微生物降解技術。
6 結語
總之，水產養殖是一門應用學科，其發展不只是依靠本學科的技術，更重要的是需要綜合生物技術，其中包括：遺傳學、營養學、病理學、內分泌以及生物工程等。在解決某一養殖物件的關鍵技術問題時，均涉及高新綜合性生物技術，所有這些生物技術的應用，無疑對漁業的發展產生著深遠而深刻的劃時代意義。
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