建立於 03 九月 2015
分類：專題報導
生物技術研究是指人們運用現代生物學、工程學和其他基礎學科的知識，按照預先的設計對生物進行控制和改造或類比生物及其功能，用來發展商業性加工、產品生產和社會服務的新興技術領域。近十幾年來，生物技術迅猛發展，呈方興未艾之勢。
目前，許多生物技術成果已在漁業上得到應用。例如，中國轉牛、羊基因魚技術已達到國際先進水平；羅非魚和虹鱒魚遺傳鏈鎖圖譜的製備及其部分數量性狀基因位元點（性別、生長、體色）的定位研究，為這些性狀的DNA分子標記輔助育種奠定了良好基礎；日本、美國、加拿大等國還相繼克隆出大麻哈、虹鱒、羅非魚、真鯛等的生長激素基因、催乳素基因及抗凍蛋白基因，並成功地在微生物中表達生產了一些魚類的生長激素和其他重要蛋白。到目前為止，國外已先後在草魚、鯉、虹鱒、羅非魚、牙鮃、扇貝、牡蠣、對蝦、鮑魚等20多種魚、蝦、貝類上得到多倍體染色體育種工程技術的成功，這些多倍體新品種的生長速度明顯快於其親本；法國、日本、挪威等國獲得的虹鱒、硬頭鱒、大西洋鮭、紅鮭等魚的雌核發育系為人工誘導雌核發育技術育種展示了廣闊前景；中國對蝦白斑病基因的破譯，為其病害防治技術提供了可靠的藥物篩選依據；水產病害檢測技術的發展也為控制疾病的發生提供了必要的措施；通過免疫手段來防治水生動物疾病已成為當前研究的熱點；另外，利用生物技術保護水生環境、治理污染也是水體生態環境保護及其產業可持續發展的重要生物工程手段。
1 基因操作技術
1．l 基因克隆
這是一種以蛋白質特殊功能為前提的克隆方法，也是基因克隆中較早採用的策略之一。首先，構建基因或cDNA表達文庫，然後將表達文庫分成若干亞文庫分別轉染細胞，通過一些特定的靈敏的生理生化指標或抗體免疫反應來檢測亞文庫表達產物的功能，在檢測得到陽性亞文庫後，一種途徑是進一步對亞文庫再分小，重複篩選，直至最後得到單克隆功能基因；另一種途徑則是利用原位免疫組化的方法分離出呈陽性反應的單細胞，進而分離出相應的功能基因。此外，還有許多新的基因克隆技術如基因組錯配篩選（GMS）、代表性差異分析（RDA）、外顯子擴增技術以及mRNA差異顯示技術也具有廣泛的應用潛力。對有代表性的水生生物（包括魚、蝦、貝及病原體微生物和病毒）基因組進行全序列測定，同時進行特定功能基因，如藥物基因、酶基因、激素多肽基因、抗病基因和耐鹽基因等的克隆和功能分析是克隆技術所研究的重點。目前已經鑒定和克隆出的基因包括：南美白對蝦抗菌肽基因，牡蠣變應原（allergen）基因、大西洋鰻和大西洋鮭抗體基因、虹鱒Vasa基因、青魚將P53基因組基因、雙鞭毛藻類真核啟始因數5A基因。條紋鱸GTH（促性腺激素）受體cDNA、鮑肌動蛋白基因、藍細菌丙酮酸激酶基因、鯉魚視紫紅質基因調節系列以及牙鮃溶菌酶基因等。
1‧2 基因轉移
基因轉移作為生物遺傳改良、培育快速生長和抗逆優良品種的有效技術手段，已成為應用技術研究發展的重點。大批量、高效轉基因方法是基因轉移研究的重點，除傳統的顯微注射法、基因槍法和精子攜帶法外，目前已發展了逆轉錄病毒介導法、電穿孔法、轉座子介導法及胚胎細胞介導法等。近幾年研究集中在目標基因篩選，如抗病基因、胰島素生長因數基因及綠色熒光蛋白基因等作為目標基因。Hayat（1991）等成功地把人的以及鮭鱒魚的生長激素顯微注射到鯰魚和鯉魚卵中；Rahman（1992）等把大鼠金屬硫結合蛋白基因和小鼠生長激素注射到單細胞階段的羅非魚卵中，獲得了大約 20％的整合率；Gross（1992）把牛生長激素基因轉移到狗魚中等。以上研究多數採用外源基因，從安全性、外源基因的表達強度和世代傳遞等方面考慮，採用魚類自身的“全魚基因”可能較為理想。Du（1992）等最先使用“全魚基因”向大西洋鮭受精卵轉移生長激素基因，獲得的轉基因魚個體重量比對照組平均大38倍。轉基因魚的子一代個體的平均重量比對照組大5．2倍。在轉基因研
究的種類上，目前已從經濟養殖魚類逐步擴展到養殖蝦、貝類及某些觀賞魚類。
1．3 基因晶片
基因晶片技術又稱基因微陣列技術，是指將大量（通常每平方釐米點陣密度高於400）核酸探針分子固定於載體（玻片或薄膜）後與標記的樣品分子（mRNA，cDNA，基因組DNA等）進行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度進而獲取樣品分子的數量和序列資訊。該技術的最大優點是可以一次性對大量樣品序列進行檢測和分析。目前，通過設計不同的探針陣列組合和使用特定的分析方法，基因晶片技術已經廣泛應用于基因表達諾測定。突變檢測、多態性分析、基因組文庫作圖及雜交測序等許多方面。基因晶片技術應用的先決條件是要有大量的已知序列的探針分子，而目前已測定的水生生物基因數目非常有限，這大大局限了基因晶片技術在水生生物功能基因組研究中的應用。
l．4 遺傳標記
限制性內切酶（RFLP）技術、隨機擴增多態性（RAPD）技術、DNA指紋分析技術、擴增片段長度多態性（AFPL）等分子標記技術用於基因多樣性分析，為種質鑒定和遺傳育種提供依據。Knox（1991）等應用質粒DNA限制片段長度的多態性分別分辨洄游和陸封大西洋鮭的種群和挪威養殖的以及蘇格蘭野生的大西洋鮭的種群差異。Moran（1996）等應用質粒DNA的變異分辨西班牙河流中的人工孵化和野生歐鱒種群並發現種群大小與質粒DNA變異的關係。Carter（1991）等和Gross（1994）等用DNA指紋譜技術分別對雌核生殖羅非魚進行鑒別和小口黑鱸的不同群體的鑒別。孫效文等（2000）將RAPD技術與SSLP（簡單序列長度多態性）技術結合起來，初步建立了鯉魚遺傳連鎖圖譜。王志勇等（ 2002）利用 AFLP技術研究了中國沿海真鯛群體的遺傳變異和趨異。
2 細胞和染色體組技術
2．l 多倍體誘導
通常動植物細胞染色體組為2組。由自然環境因素或人工特殊處理形成2組以上染色體的動物體稱為多倍體。一般人工誘導的主要目的在於利用三倍體，三倍體具有生長快、淨肉率高、肉質好，生命周期長等特點；另外三倍體還有利於種群控制，具有較高的抗病力和抗逆性。Valenti(1975）等對澳大利亞羅非魚的受精卵進行冷處理，誘導出75％的多倍體且孵化率高達90％。洪雲漢（1990）對鱅魚卵在第一次卵裂前進行熱處理，獲得了56．3％的四倍體。Myers（1991）比較了分別由正常受精卵經熱處理和從四倍體與二倍體雜交獲得的兩類三倍體硬頭鱒，發現前者前期生長較差，後者的存活率高但受精率較低。Guo（1996）等採用二倍體和四倍體太平洋牡蠣生產出100％的三倍體牡蠣，其個體比正常二倍體大13％～51％。與在河口養殖近4個月的結果表明三倍體的閉殼肌比對照組重73％，平均體組織濕重高36％。大多數三倍體貝類在夏季期間性腺不成熟，在生長期閉殼股長的重量和糖元指標明顯高於對照組。
2．2 雌核發育
雌核發育指的是卵子需要精子的啟動但精子並不提供遺傳物質的一種單性生殖方式。自然界存在這種單性生殖的水生動物，人工誘發手段也可使未受精卵進行雌核生殖，但產生的個體絕大多數是單倍體，難以存活，需緊接著二倍化的特殊處理。誘發雌核發育除了可以加快建立選育系和控制性別外，還可以使一些稀有的隱性等位基因顯現而產生優良性狀，使具有重要經濟性狀的顯性基因轉為純合狀態，雌核發育後代還可用來鑒定魚類的近交衰退現象等。蔣一矽（1982）等和吳清江（1981）等曾分別成功地應用γ射線輻射魚類精液後誘導紅鯽魚卵和鯉魚卵的雌核生殖。蔡難兒（1995）首先報道了採用與研究魚類人工誘導雌核發育相類似的四步誘導法對中國對蝦進行人工誘導雌核發育，育出三批雌核發育的個體，但要大規模生產仍存在一定的困難。李勝忠等（1997）採取熱休克的方法誘導虹鱒二倍體雌核發育，三次實驗均獲成功。美國為了限制移植的草魚和白鰱
的種群繁殖，用紫外線處理過的鯉魚精子誘導白鰱卵的雌核發育，再經溫差休克處理，獲得了雌核發育魚，但同樣存在受精率和孵化率低的問題。
2‧3 細胞核移植
細胞核移植技術是將一細胞核移植到另一去核的未受精卵或細胞內的生物技術。我國著名生物學家童第周等率先在金魚和魚中進行同種魚的細胞核移植，隨後在這兩種魚間進行了不同亞科之間的細胞核移植，獲得了多種移植的核質雜魚。Yan（1985）等成功地進行了真骨魚類中兩種不同亞科種類之間的核移植，即將草魚的細胞核移植到團頭魴的細胞質，獲得了核質雜交魚。其外表特徵與草魚相似，說明遺傳信息的表達主要是受移入的魚細胞核的影響，而且核質雜交魚的生長率比草魚略快但比短吻鯿要快得多，其生產的精子可與草魚卵回交並獲得了後代。林禮堂等（1996）把鯽魚、鯪魚和尼羅羅非魚的體細胞核移植到鯉魚的成熟去核卵中獲得了不同發育階段的胚胎和幼魚。目前，中國在魚類細胞核移植技術的理論研究和實際應用方面都居世界領先地位。
2．4 細胞培養技術
細胞培養技術是把生物的細胞分離、培養、誘導再生或快速繁殖的技術。目前這項技術已廣泛應用於魚類細胞、珍珠貝外套膜上皮細胞以及海藻細胞等的培養。水產動物細胞培養起始於魚類，同時以魚類細胞培養研究開展得較為系統，已建立的魚類細胞系也較多。這些細胞系具有多方面的用途，可代替活體動物用於病毒研究，可用於染色體制作等遺傳學研究，用於製作細胞疫苗，作為細胞核移植育種研究中供體細胞核來源，以及毒性和水質監測等的指示生物（細胞比魚體對有毒物質更敏感）等。張念慈等（1981）建立了草魚吻端組織二倍體ZC-7901細胞系，陳敏容等1985年建立了鯽魚異倍體細胞系CAB－80，左文功等1986年建立了草魚腎組織CIK細胞系，童裳亮等1989年建立了虹鱒巨噬細胞系。與魚類相比，貝類、蝦類等水產動物的細胞培養研究國內外報道較少，如Hanson等1976年建立了淡水蝸牛胚胎細胞系，徐亞立等最近建立了斑節對蝦PMO細胞系。
3 疾病診斷技術
3．l 單克隆抗體技術
單克隆抗體技術是K和M於1975年發展起來的利用雜交瘤細胞製備大量針對某一抗原決定簇的特異性抗體的技術。單克隆抗體與常規血清抗體相比，特異性強，能識別單一抗原決定簇，且容易製備，能保持細胞系重複獲得相同抗體，因而在水產養殖病原體檢測中得到廣泛應用。如應用於診斷海灣扇貝的鰓立克次體、診斷與魚類及牡蠣相結合的淋巴細胞病毒、檢測菲律賓蛤仔棕環病因弧菌P1。另外，近年來已有人利用此技術製備了抗鰻弧菌的單克隆抗體的抗嗜水單胞菌外毒素的單克隆抗體。
3．2 酶聯免疫吸附檢測
酶聯免疫吸附檢測（EL1SA）是將抗原一機體的免疫反應和酶的催化反應相結合的技術。其基本原理是將抗原或抗體吸附於固相載體上，然後與酶標記的抗原或抗體結合，在適當的底物參與下，使基質水解而呈色，通過呈現的顏色變化來顯示抗原抗體特異反應的存在。ELISA具有靈敏度高、特異性強、反應快速等特點，而且結果可以定量，也可對抗原、抗體以及抗原抗體複合物進行定位分析。ELISA法已用於IPNV、VHSV、CCV、PERV、SVCV、GCHV及IHNV的檢測中。隨著技術方法的不斷更新和改進，特別是單克隆抗體等的應用，使檢測靈敏度和異性大幅度提高（Ristow et al，1991）。Davis（1994）等結合細胞培養技術檢測IPNV，大大增強了檢測的特異性、敏感性和客觀性。
3．3 核酸雜交技術
核酸雜交技術是利用特定標記的DNA或RNA探針和病原體生物中的與探針互補的靶核苷酸序列進行雜交，以此來確定宿主是否攜帶有病原體的一類分子生物學技術，可分為Southern雜交、Northern雜交和核酸原位雜交。該技術以其靈敏度高、特異性強和檢驗快速等優點，近年來在對蝦病毒等水產養殖病原體檢測中倍受青睞。Subramanian（1993）利用所合成的CDNA探針，通過核酸雜交試驗檢測感染細胞和組織中的水和呼腸弧病毒的dsDNA獲得成功；Lupinai等（1993）應用製備的RNA探針通過RNA－RNA印迹雜交法分離鑒定出一種新的病毒即水生呼腸弧病毒A群。Dopazo （1994）等將製備的cDNA探針用於IPNV的檢測和診斷，從接種病毒4～8h的培養細胞中即檢測到IPNV。
3‧4 PCR技術
聚合酶鏈式反應（PCR）是體外酶促合成迅速擴增特異DNA片段的一種方法。在魚類等動物疾病診斷中PCR技術的應用才剛剛開始，就已經顯示出其巨大的潛力及廣闊的應用前景（Davies etaL 1994）。Arakawa（1990）等應用PCR技術檢測了虹鱒魚IH－NV，並以生物素標記的寡核苷酸探針鑒定了產物的特異性。Boyle（1991）等用PCR法檢CCV的DNA，靈敏度達0．lpg，並成功地檢測出CCV攜帶者。Lastra（1994）等應用逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT－PCR）對經培養細胞分高純化的病毒進行檢測，靈敏度達到lpg；另外，他們還對銀大馬哈魚、鱒魚組織中的IPNV進行檢測並進行擴增。對於其他水生動物病毒的檢測，早在1990年就有關於應用PCR技術從對蝦組織中檢測出核型多角體病毒的報導（Vickers，1990）。Chang等利用PCR技術首次成功地進行對蝦病毒的擴增。Wang等（1996）用PCR方法檢測對蝦杆狀病毒，並獲得了預計的擴增產物。此外，應用PCR技術也可檢測貝類腸
道病毒以及水或水生生物體內富集的病毒或細菌。
4 免疫防治技術
4‧1 免疫增強劑
包括特異性免疫和非特異性免疫增強劑，但更多的是增強非特異性免疫機能。其主要是通過活化自身的免疫機能而顯示機體的防禦效果，具有作用廣泛、安全性高等特點。免疫增強劑的功能是多方面的，在甲殼動物中，可活化血淋巴中的吞噬細胞，提高吞噬病原菌能力；刺激血淋巴中抗菌、溶菌活力的產生或升高；啟動酚氧酶原系統產生識別信號及介導吞噬等。在魚類中，可啟動嗜中性粒細胞及巨噬細胞的吞噬作用；啟動淋巴細胞產生或分泌淋巴因數以協調體液免疫和細胞免疫；刺激抗體的產生和補體的生成等。目前應用較多的免疫增強劑主要有葡聚糖、脂多糖、細菌多肽、左旋咪華、幾丁質、雞蛋產物、維生素和激素等。Hardie等 （1991）討道給予大量維生素C的魚類，其補體活動水平得到提高。大西洋鮭魚經注射酵母葡聚糖後，也表現出補體活動得到提高（Engstad etal．1992）；使用免疫增強劑也能夠影響溶菌酶的活性，溶菌酶是一種水解酶，存在於魚類的粘液、血清和巨噬細胞中，能殺死病原微生物而使魚體獲得保護（Engstad et al．1992）。此外，NK細胞也能被生長激素（Kajita et al．1992）和左旋咪華（Kajita et al．1990）所啟動。
4‧2 DNA疫苗
在水產動物疾病防治上，傳統的疫苗是用滅活菌體疫苗或弱毒性的菌體疫苗，前者往往效果不明顯，後者卻仍可造成輕微感染或回復突變為病原株的危險。DNA疫苗又稱基因疫苗或核酸疫苗，它是將病毒或微生物中負責轉譯抗原蛋白的基因片段分離出來，在體外與載體連接形成重組DNA，然後轉移入宿主細胞，在宿主細胞內表達抗原蛋白，達到免疫的效果。這種疫苗製備方法簡單，成本低，適宜大規模生產，它在體內能長期表達，不斷刺激機體的免疫系統，可組成多價疫苗，即一種疫苗能誘導產生針對多個抗原表位的免疫保護作用。魚用DNA疫苗主要針對的是病毒性魚病，目前研究應用的有出血性敗血病毒（VHSV）、傳染性造血組織壞死病毒（IHNV）、傳染性胰臟壞死病毒（IPNV）、鰻魚病毒（EVA、EVEX）、草魚呼腸弧病毒（FRV）、文蛤病毒等疫苗。Lorenzen （1999）針對VHSV病毒G蛋白構建的DNA疫苗能夠誘導70％的虹鱒產生較高水準的免疫保護性。Traxler（1999）等以編碼IHNV病毒G蛋白（PCMV4－G）的裸DNA免疫大麻哈魚，8周後，用IHNV病毒攻擊，保護率可達40％～100％。當然，DNA疫苗作為一代新型疫苗，還有不完善的地方，其中最引人關注的是安全性問題，人們擔心DNA疫苗會整合到宿方的染色體上造成插入突變，不過目前在實驗中尚未發現這種現象。
4‧3 反義技術
反義技術是近十多年來發展起來的反義核酸技術和核酶技術的總稱，可以用來特異性地阻斷病毒功能的發揮。反義核酸可分為反義RNA技術和反義DNA技術，但一般常指反義RNA技術。反義RNA是以DNA有義鏈為模板合成的RNA及其衍生物，它可通過與相應的mRNA互補結合而阻斷其功能。1985年首次將病毒存活所必需的酶基因或結構基因的反義核酸和表達載體連接，轉入細胞內或將反義核酸直接注入細胞，發現者對病毒有抑制作用。目前，使用人工合成的反義RNA已在原核細胞和真核細胞中成功地抑制了多種病毒基因的表達。核酶則是一種具有催化作用的RNA，它通過堿基配對與靶RNA相互識別。結合並催化水解靶RNA，因此它既有反義RNA的作用，又能以序列特異性地切割RNA。實驗證明，核酶也可以抑制病毒的複製和表達，轉入基因可以傳代，現在已有不少研究顯示核酶可用於對病毒靶RNA進行切割。不過目前還未見到有關成功應用反義技術來治療水產養殖動植物病毒性疾病的報導，但作為一種特異性較強的檢測技術，反義技術是很有開發潛力的。
5 環境生物修復技術
水生環境日趨惡化，對漁業造成極大危脅，病害的暴發主要是由環境污染所造成的。環境生物修復技術是一個新的研究發展領域，國外採用生物修復技術改良水生環境，已取得新的進展。所謂環境生物修復技術就是利用生物製劑去除水生環境中的有害廢棄物，應用微生物的機理，降解多種污染物，改善水生環境。生物修復是比生物降解含義更為廣泛，又以生物降解為重點的環境生物技術。其方法包括利用活機體、或其製作產品降解污染物，減少毒性或轉化為無毒產品，富集和固定有毒物質（包括重金屬等），大尺度的生物修復還包括生態系統中的生態調控等。這種生物技術可以應用水產規模化養殖和工廠化養殖、石油污染、重金屬污染、城市排汙以及海洋其他廢物（水）的處理等方面。關於微生物對環境反應的動力學機制、降解過程的生化機理、生物感測器、海洋微生物之間以及與其他生物之間的共生關係和互利機制，抗附著物質的分離純化等領域的研究有待於進一步深入。目前已進行的研究有：研究轉重金屬硫蛋白基因藻類對海水環境中重金屬的吸附能力；五油降解微生物在修復被五油污染的水環境上的可行性及應用潛力；海洋磁細菌在去除和回收海水環境中重金屬上的應用潛力；用杆狀菌清除養魚場污水中的氮，用分子技術篩選作為海水養殖餌料的微藻，分離出耐冷的癸烷降解細菌，研究了海洋環境中多芳香化烴的微生物降解技術。
6 結語
總之，水產養殖是一門應用學科，其發展不只是依靠本學科的技術，更重要的是需要綜合生物技術，其中包括：遺傳學、營養學、病理學、內分泌以及生物工程等。在解決某一養殖物件的關鍵技術問題時，均涉及高新綜合性生物技術，所有這些生物技術的應用，無疑對漁業的發展產生著深遠而深刻的劃時代意義。